فرمت فایل : word (لینک دانلود پایین صفحه) تعداد صفحات 41 صفحه
-1مواد لازم
2-1-1: نمونه
2-1-1-1: انتخاب نمونه: نمونه ها شامل تخم ، لارو ، کنه بالغ خونخورده و کنه نر بودند ، این نمونه ها از بخش تک یاخته شناسی – آزمایشگاه تحقیقات بند پایان موسسه رازی تهیه شده بودند ، نمونه ها مربوط به سه منطقه بوشهر ، کردان کرج و بوئین زهرا بودند.
نمونه های کنه بالغ خونخورده بعد از جمع آوری از صحرا به منظور تخم گذاری در آزمایشگاه در انکوباتور 26 درجه سانتیگراد و رطوبت 60 تا 70 درصد قرار داده شدند ، بعد از تخم گذاری ، مقداری از نمونه های تخم به منظور تهیه لارو در انکوباتور قرار داده شدند و سایر نمونه های تخم کنه در دمای 5 درجه سانتیگراد به منظور تحقیقات بعدی نگهداری شدند .
2-2 روش استخراج :
استخراج DNA ژنومی در این تحقیق با دو روش انجام گردید :
الف) استخراج DNA به روش فنل – کلروفرم به همراه پروتئیناز K
ب ) استخراج DNA به روش جذب برروی فیبرهای شیشه ( کیت)
2-2-1: مواد لازم برای استخراج DNA به روش فنل –کلروفرم به همراه پروتئیناز K (d oliveria et al .,1997)
- ازت مایع ، ازت مایع جهت انجماد و پودر کردن نمونه (تخم، کنه بالغ و لارو)بکارگرفته شد.
- محلول شماره 1 : این محلول جهت لیز و آزادسازیDNA از سلول های استفاده میشود،که حاوی ترکیبات زیر میباشد:
Tris-HCl 50mM
SDS 1%
NaCl 100mM
EDTA 50mM
pH این محلول درنهایت باید 8 باشد ، این محلول در تیوبهای کوچک تقسیم شده و در فریزر نگهداری می شود .
- محلول پروتئیناز K با غلظت 20mg /ml
- محلول شماره 2: محلول فنل – کلروفرم - ایزو آمیل الکل به نسبت ( 1: 24:25) می باشد .
- اتانول مطلق 96 درجه
- اتانول 75 درجه
- TE بافر که حاوی ترکیبات زیر می باشد :
10mM Tris – HCl ( pH:8)
1 mM EDTA (pH:8)
2-2-1-1: طرز تهیه محلول فنل – کلروفرم – ایزوآمیل الکل :
برای استفاده از فنل در استخراج DNA ، ابتدا باید pH آن را در بیش از 8/7 متعادل کرد ، زیرا DNA در pH اسیدی تمایل به ورود به فاز فنلی رادارد ، در کارهای مولکولی از فنل با درجه خلوص بالا استفاده می شود که بصورت تجاری وجود دارد . رنگ فنل درهنگام استفاده شفاف و بی رنگ باشد .
ابتدا فنل را در 68 درجه ذوب کرده و میزان 1/0 درصد آن هیدروکسی کینولین
(Hydroxy quinoline) اضافه می گردد . این ماده یک آنتی اکسیدان بوده و تا حدودی مانع فعالیت DNase شده و همچنین جاذب یونهای فلزی است . علاوه بر این با ایجاد رنگ در فنل ،هنگام استخراجDNA براحتی فاز ارگانیک را قابل تشخیص میکند،بعد از ذوب فنل با اندازه گیری حجم مساوی محلول 5/0مولار Tris با pH:8 اضافه میشود، این مرحله تا وقتی که pH فنل به حد دلخواه نرسیده باشد ، ادامه مییابد.پس از تنظیم pH فنل به میزان 1/0حجم آن از Tris با pH:8 روی آن نگه داشته و به مقدار 2/0 درصد به فاز آبی ، 2- مرکاپتواتانول اضافه می شود ، در نهایت به محلول فنل به نسبت 25 ( فنل) 24 (کلروفرم) 1 (ایزوآمیل الکل) اضافه می گردد و در بطری ریخته می شود ، این محلول در یخچال در دمای 5 درجه سانتیگراد به مدت یک ماه پایدار است .( Sambrook,2001)
2-2-1-2 : مراحل استخراج DNA با روش فنل – کلروفرم :
لیز,و پودر نمونه کنه , شامل کنه بالغ خون خورده (ماده ) ،کنه نر یا تخم و لارو آن باشد .
در این مرحله تیوب 5/1 سی سی حاوی نمونه را داخل ظرفی که حاوی ازت مایع است ، گذاشته می شود . ازت مایع باعث انجماد نمونه شده و در نتیجه براحتی می توان با یک میله شیشه ای یا پلاستیکی نمونه را در حالی که در داخل ازت مایع قرار دارد پودر و هموژنیزه نمود .
2- محلول شماره یک (Lysate) به میزان 400 میکرولیتر به نمونه لیز شده که از قبل در داخل میکروتیوب 5/1 سی سی آماده شده است اضافه شد .
3- محلول شماره 2 (پروتئیناز K) به میزان 20 میکرولیتر اضافه شد .
4- در 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت قرار داده شد .
5- 400 میکرولیتر محلول شماره 3 ( فنل ) اضافه شد ، دراین مرحله میکروتیوب به آرامی چند بار سرو ته شد تا دو محلول کاملا مخلوط شوند. سریع تکان دادن سبب قطعه قطعه شدن ژنوم می شود در طی این مرحله 2 فاز تشکیل می شود ، که جهت بهتر تشکیل شدن 2 فاز سانتریفوژ شد .
6- به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ شد .
- -بعد از سانتریفوژ ، فاز آبی را که حاوی DNA است تا حد ممکن جدا شده و به یک میکروتیوب جدید منتقل شد، در این مرحله دقت شد که فاز پروتئینی برداشت نگردد .
- – 1/0 حجم نمونه از استات سدیم 3 مول به محلول اضافه شد .
- – به میزان 2 برابر حجم محلول جدا شده به آن الکل مطلق اضافه شد .
- – محلول به مدت 20 دقیقه در 20- درجه سانتیگراد قرار داده شد .
- – محلول بمدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید .
- – محلول رویی کاملا خالی گردیده ، به آن محلول اتانل 75 درصد هم حجم قبلی اضافه شد و مجدداً به مدت 10 دقیقه در 13000دور سانتریفوژ گردید.
تحقیق کامل درباره مواد و روشها و استخراج DNA